Astratto
Nella pubblicazione intitolata "Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR" (Eurosurveillance 25 (8) 2020) gli autori presentano un flusso di lavoro diagnostico e protocollo RT-qPCR per il rilevamento e la diagnostica del 2019-nCoV (ora noto come SARS-CoV-2), che sostengono di essere convalidato, oltre ad essere una solida metodologia diagnostica per l'uso in ambienti di laboratorio di sanità pubblica.
Alla luce di tutte le conseguenze derivanti da questa stessa pubblicazione per le società di tutto il mondo, un gruppo di ricercatori indipendenti ha eseguito una revisione punto per punto della suddetta pubblicazione in cui 1) tutti i componenti del progetto di test presentato sono stati sottoposti a controlli incrociati, 2) il Le raccomandazioni del protocollo RT-qPCR sono state valutate rispetto alla buona pratica di laboratorio e 3) i parametri sono stati esaminati rispetto alla letteratura scientifica pertinente che copre il campo.
Il protocollo RT-qPCR pubblicato per il rilevamento e la diagnostica di 2019-nCoV e il manoscritto soffrono di numerosi errori tecnici e scientifici, tra cui un design del primer insufficiente, un protocollo RT-qPCR problematico e insufficiente e l'assenza di una convalida accurata del test. Né il test presentato né il manoscritto stesso soddisfano i requisiti per una pubblicazione scientifica accettabile. Inoltre, non vengono menzionati gravi conflitti di interesse degli autori. Infine, il brevissimo lasso di tempo tra la presentazione e l'accettazione della pubblicazione (24 ore) significa che un processo sistematico di revisione tra pari non è stato eseguito qui o di scarsa qualità problematica. Forniamo prove convincenti di numerose inadeguatezze, errori e difetti scientifici.
Considerando le imperfezioni scientifiche e metodologiche qui presentate, siamo fiduciosi che il comitato editoriale di Eurosurveillance non abbia altra scelta che ritirare la pubblicazione.
Rapporto di revisione conciso
Questo articolo mostrerà numerosi gravi difetti nel documento Corman-Drosten, il cui significato ha portato a diagnosi errate a livello mondiale di infezioni attribuite a SARS-CoV-2 e associate alla malattia COVID-19. Siamo di fronte a rigidi blocchi che hanno distrutto la vita e il sostentamento di molte persone, l'accesso limitato all'istruzione e queste restrizioni imposte dai governi di tutto il mondo sono un attacco diretto ai diritti fondamentali delle persone e alle loro libertà personali, con conseguenti danni collaterali per intere economie su un scala globale.
Ci sono dieci problemi fatali con il documento Corman-Drosten che delineeremo e spiegheremo più dettagliatamente nelle sezioni seguenti.
Il primo e importante problema è che il romanzo Coronavirus SARS-CoV-2 (nella pubblicazione denominata 2019-nCoV e nel febbraio 2020 denominato SARS-CoV-2 da un consorzio internazionale di esperti di virus) si basa su sequenze in silico (teoriche) , fornito da un laboratorio in Cina [1], perché all'epoca né il materiale di controllo del SARS-CoV-2 infettivo ("vivo") o inattivato né l'RNA genomico isolato del virus erano a disposizione degli autori. Ad oggi nessuna convalida è stata eseguita dall'autore sulla base di virus SARS-CoV-2 isolati o di loro RNA a lunghezza intera. Secondo Corman et al .:
"Abbiamo mirato a sviluppare e implementare una solida metodologia diagnostica da utilizzare in ambienti di laboratorio di sanità pubblica senza disporre di materiale antivirus" [1]
L'attenzione qui dovrebbe essere posta sui due obiettivi dichiarati: a) sviluppo eb) implementazione di un test diagnostico da utilizzare in ambienti di laboratorio di sanità pubblica . Questi obiettivi non possono essere raggiunti senza avere a disposizione materiale virale effettivo (ad esempio per determinare la carica virale infettiva). In ogni caso, solo un protocollo con la massima accuratezza può essere l'obiettivo primario e obbligatorio in qualsiasi scenario-esito di questa portata. La determinazione della carica virale critica è un'informazione obbligatoria ed è responsabilità del gruppo di Christian Drosten eseguire questi esperimenti e fornire i dati cruciali.
Tuttavia queste sequenze in silico sono state utilizzate per sviluppare una metodologia di test RT-PCR per identificare il suddetto virus. Questo modello si basava sul presupposto che il nuovo virus fosse molto simile al SARS-CoV del 2003 in quanto entrambi sono beta-coronavirus.
Il test PCR è stato quindi progettato utilizzando la sequenza genomica di SARS-CoV come materiale di controllo per il componente Sarbeco; lo sappiamo dalla nostra comunicazione e-mail personale con [2] uno dei coautori dell'articolo Corman-Drosten. Questo metodo per modellare SARS-CoV-2 è stato descritto nel documento Corman-Drosten come segue:
“ L'istituzione e la convalida di un flusso di lavoro diagnostico per lo screening 2019-nCoV e la conferma specifica, progettato in assenza di isolati di virus disponibili o di campioni di pazienti originali. La progettazione e la convalida sono state rese possibili dalla stretta parentela genetica con la SARS-CoV del 2003 e aiutate dall'uso della tecnologia degli acidi nucleici sintetici ".
La reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) è un'importante tecnologia biomolecolare per rilevare rapidamente frammenti di RNA rari, noti in anticipo. Nella prima fase, le molecole di RNA presenti nel campione vengono trascritte inversamente per produrre cDNA. Il cDNA viene quindi amplificato nella reazione a catena della polimerasi utilizzando una coppia di primer specifica e un enzima DNA polimerasi termostabile. La tecnologia è altamente sensibile e il suo limite di rilevamento è teoricamente 1 molecola di cDNA. La specificità della PCR è fortemente influenzata da errori di progettazione biomolecolare.
Che cosa è importante quando si progetta un test RT-PCR e il test quantitativo RT-qPCR descritto nella pubblicazione Corman-Drosten?
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Catalogo riassuntivo degli errori trovati nel documento
Il documento Corman-Drosten contiene i seguenti errori specifici:
1. Non esiste alcun motivo specifico per utilizzare queste concentrazioni estremamente elevate di primer in questo protocollo. Le concentrazioni descritte portano ad un aumento dei legami aspecifici e all'amplificazione del prodotto PCR, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
2. Sei posizioni instabili non specificate introdurranno un'enorme variabilità nelle implementazioni di laboratorio del mondo reale di questo test; la confusa descrizione aspecifica contenuta nel documento Corman-Drosten non è adatta come protocollo operativo standard, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
3. Il test non è in grado di discriminare tra l'intero virus e frammenti virali. Pertanto, il test non può essere utilizzato come diagnostica per virus intatti (infettivi), rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2 e fare inferenze sulla presenza di un'infezione.
4. Una differenza di 10 ° C rispetto alla temperatura di annealing Tm per la coppia di primer1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) rende inoltre il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
5. Un errore grave è l'omissione di un valore Ct al quale un campione è considerato positivo e negativo. Questo valore Ct non si trova anche nelle richieste di follow-up, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
6. I prodotti della PCR non sono stati convalidati a livello molecolare. Questo fatto rende il protocollo inutile come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
7. Il test PCR non contiene né un controllo positivo unico per valutare la sua specificità per SARS-CoV-2 né un controllo negativo per escludere la presenza di altri coronavirus, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare SARS-CoV-2 virus.
8. Il disegno del test nel documento Corman-Drosten è così vago e imperfetto che si può andare in dozzine di direzioni diverse; niente è standardizzato e non ci sono SOP. Ciò mette molto in dubbio la validità scientifica del test e lo rende inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
9. Molto probabilmente, il documento Corman-Drosten non è stato sottoposto a peer review, rendendo il test inadatto come strumento diagnostico specifico per identificare il virus SARS-CoV-2.
10. Troviamo gravi conflitti di interesse per almeno quattro autori, oltre al fatto che due degli autori dell'articolo Corman-Drosten (Christian Drosten e Chantal Reusken) sono membri del comitato editoriale di Eurosurveillance. Il 29 luglio 2020 è stato aggiunto un conflitto di interessi (Olfert Landt è CEO di TIB-Molbiol; Marco Kaiser è ricercatore senior presso GenExpress e funge da consulente scientifico per TIB-Molbiol), che non è stato dichiarato nella versione originale (e lo è ancora mancante nella versione PubMed); TIB-Molbiol è la società che è stata "la prima" a produrre kit PCR (Light Mix) basati sul protocollo pubblicato nel manoscritto Corman-Drosten e, secondo le loro stesse parole, hanno distribuito questi kit PCR prima della pubblicazione anche presentato [20]; inoltre, Victor Corman e Christian Drosten ha omesso di menzionare la loro seconda affiliazione: il laboratorio di test commerciale “Labor Berlin”. Entrambi sono responsabili della diagnostica antivirus in loco [21] e la società opera nel campo dei test PCR in tempo reale.
Alla luce del nostro riesame del protocollo del test per identificare SARS-CoV-2 descritto nel documento Corman-Drosten, abbiamo identificato errori e fallacie intrinseche che rendono inutile il test PCR SARS-CoV-2.
Conclusione
La decisione su quali protocolli di test pubblicare e rendere ampiamente disponibili è nelle mani di Eurosurveillance. La decisione di riconoscere gli errori evidenti nel documento Corman-Drosten ha il vantaggio di ridurre notevolmente i costi umani e le sofferenze future.
Non è nel migliore interesse di Eurosurveillance ritirare questo documento? La nostra conclusione è chiara. Di fronte a tutti gli enormi difetti ed errori di progettazione del protocollo PCR descritti qui, concludiamo: non è rimasta molta scelta nel quadro dell'integrità e della responsabilità scientifica.
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Autori
1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W + W Research Associate, Lörrach, Germania
2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra ), Ex 3D Artist / Scientific Visualizations at CeMM - Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences (2019-2020), University for Applied Arts - Department for Digital Arts Vienna, Austria
3) Dr. Michael Yeadon BS (Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Amministratore delegato, Yeadon Consulting Ltd, ex Chief Scientist Pfizer, Regno Unito
4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Regno Unito
5) Kevin McKernan , BS Emory University, Chief Scientific Officer, fondatore di Medical Genomics, ha progettato la pipeline di sequenziamento presso WIBR / MIT per il Progetto Genoma Umano, ha inventato e sviluppato il sequencer SOLiD, ha ottenuto brevetti relativi a PCR, DNA Isolation and Sequencing, USA
6) Prof.Dr.Klaus Steger , Dipartimento di Urologia, Urologia e Andrologia Pediatrica, Andrologia Molecolare, Centro di Ricerca Biomedica dell'Università Justus Liebig, Giessen, Germania
7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), Biochimico e farmacologo industriale, Loerrach, Germania
8) Dr.Lidiya Angelova , MSc in Biology, PhD in Microbiology, Ex ricercatrice presso il National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA
9) Dr. Fabio Franchi , Ex Dirigente Medico (MD) in un Reparto di Malattie Infettive, specializzato in “Malattie Infettive” e “Igiene e Medicina Preventiva”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italia
10) Dr. med. Thomas Binder , Internista e Cardiologo (FMH), Svizzera
11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich , specialista in radiologia diagnostica, medico capo presso il Centro di radiologia del Collm Oschatz-Hospital, Germania
12) Prof.Dr.Makoto Ohashi , Professore emerito, PhD in Microbiology and Immunology, Tokushima University, Japan
13) Dott. Stefano Scoglio , B.Sc. Ph.D., Microbiologo, Nutrizionista, Italia
14) Dott.ssa Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specialista in Medicina di laboratorio (chimica clinica), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Paesi Bassi
15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Chimica Ambientale e Tossicologia. DGI Consulting Services, Oslo, Norvegia
16) Dr. Rainer J. Klement , PhD. Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Ospedale Leopoldina di Schweinfurt, Germania
17) Dr.Ruth Schruefer , PhD, genetica umana / immunologia, Monaco, Germania,
18) Dra. Berber W. Pieksma , medico generico, Paesi Bassi
19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), Neurologo consulente, Paesi Bassi
20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Biologo molecolare), specialista in PI, BDC Basilea, Svizzera
21) Dr.Kevin P.Corbett , MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Scienze sociali (Science & Technology Studies) Londra, Inghilterra, Regno Unito
22) Prof.Dr.Ulrike Kämmerer , specialista in virologia / immunologia / biologia umana / biologia cellulare, ospedale universitario di Würzburg, Germania
Appunti
[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Rilevamento del nuovo coronavirus del 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR in tempo reale. Euro Surveill. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
[2] Comunicazione e-mail tra il Dr. Peter Borger e il Dr. Adam Meijer: materiale supplementare
[3] Jafaar et al., Correlazione tra 3790 campioni di reazione a catena della polimerasi quantitativa-positivi e colture cellulari positive, inclusi 1941 isolati di Coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603
[4] BBC, 21 gennaio 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836 ;
Archivio: https://archive.is/0qRmZ
[5] Google Analytics - COVID19-morti in tutto il mondo: https://bit.ly/3fndemJ
Archivio: https://archive.is/PpqEE
[6] Test di laboratorio per il COVID-19 Emergency Response Technical Center, NIVD sotto
China CDC, 15 marzo 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf
[7] Manuale sulla PCR in tempo reale Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf
Nolan T, Huggett J, Sanchez E. Guida alla buona pratica per l'applicazione della PCR quantitativa (qPCR) Prima edizione 2013
[8] Trestan Pillonel et al, Lettera all'editore: rilevamento SARS-CoV-2 mediante RT-PCR in tempo reale: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/
[9] Kurkela, Satu e David WG Brown. "Tecniche di diagnostica molecolare." Medicina 38.10
(2009): 535-540.
[10] Wolfel et al., Valutazione virologica dei pazienti ospedalizzati con COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x
[11] Strumento web Thermofischer Primer Dimer: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library /thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html
[12] Primer-BLAST, NCBI - National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. La
sequenza del genoma del coronavirus associato alla SARS. Science 300 (5624): 1399-1404.
[14] Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 isolato Wuhan-Hu-1, genoma completo
: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947
[15] Borger P. Un Coronavirus simile alla SARS era previsto ma non è stato fatto nulla per essere preparati. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared ;
Archivio: https://archive.is/i76Hu
[16] Processo di valutazione / revisione del documento Eurosurveillance: https://www.eurosurveillance.org/evaluation
[17] Raccomandazione ufficiale del protocollo e del manoscritto Corman-Drosten dell'OMS, pubblicata il 13 gennaio 2020 come versione 1.0 del documento:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf ; archivio: https://bit.ly/3m3jXVH
[18] Raccomandazione ufficiale dell'OMS per il protocollo Corman / Drosten RT-qPCR, che
deriva direttamente dalla pubblicazione Eurosurveillance, versione documento 2-1, pubblicata il
17 gennaio 2020: https://www.who.int/ docs / default-source / coronaviruse / protocol-v2-
1.pdf? sfvrsn = a9ef618c_2
[19] Comitato editoriale di Eurosurveillance, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets / imgs / 2020-09-Editorial% 20Board% 20PDF.pdf ;
Archivio: https://bit.ly/2TqXBjX
[20] Istruzioni per l'uso LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, 11 gennaio 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1 ) .pdf
Archive, timestamp - 11 gennaio 2020: https://archive.is/Vulo5 ;
Archivio: https://bit.ly/3fm9bXH
[21] Christian Drosten e Victor Corman, responsabili della diagnostica virale al Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archivio: https://archive.is/CDEUG
[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Colture virali per la
valutazione dell'infettività COVID- 19. Revisione sistematica. Revisione sistematica doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4
[23] Kim et al., The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062
[24] Risposta dell'ECDC al dott. Peter Borger, 18 novembre 2020:
materiale supplementare
[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer e team, sondaggio e tabella Primer-BLAST:
materiale supplementare
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